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1、高通量测序样品处理推荐流程


组织样品的处理

准备:干重:≥300mg/样品。(注:不同类型的样品DNA/RNA产量差别较大,具体送样量以达到质检要求为准。)
新鲜剥离样品,快速清洗,分割,
1)对于进行DNA提取的样品,须置于无DNase器皿中,速冻存于-20℃以下。
2)对于进行RNA提取的样品,推荐处理方法如下:
提前2小时冰上预冷生理盐水或PBS(所用溶液需用DEPC处理过的水配制,器皿无DNase及RNase);
从活体切取所需组织,置于冰上平皿内;加入预冷的生理盐水或PBS至淹没组织,漂洗去除血渍污物,重复1次(该步骤为超净台操作,操作时间不宜超过10 min);
用滤纸吸干样品表面液滴,剪成约0.2-0.5cm见方的小块(组织块越小,保存效果越好);
放入加有3~5倍体积TRIzol或 RNAlater的离心管或冻存管中(RNAlater需在4°C下过夜以允许溶液渗透进入组织);
液氮速冻后用封口膜封口。
运输方式:72小时内干冰运输。
备份:接收样品前要求客户分装备份,用于样品检测不合格时分析原因。

细胞(培养微生物)样品的处理

准备,贴壁或悬浮细胞:≥5×106细胞/样品。(注:不同类型的细胞DNA/RNA产量差别较大,具体送样量以达到质检要求为准。)1600rpm,3-5min离心收集细胞,弃上清,
1)对于进行DNA提取的样品,须速冻存于-20℃以下。
2)对于进行RNA提取的样品,推荐处理方法如下:
RNA提取操作前,将实验器材高温高压灭菌,如果条件允许建议使用RNase清除剂仔细擦拭超净台台面、操作器材表面,清除外源性RNase,避免RNA降解。实验过程中尽量戴两付PE手套,接触操作台以外物品后更换外层PE手套。
冰上预冷PBS(用DEPC处理过的水配制,器皿、移液器枪头、离心管等无DNase及RNase);
贴壁细胞:倒去培养液后,加入适量预冷PBS漂洗一次(避免大力吹洗损失细胞),按每10cm2(35mm直径平皿)培养面积加1mL TRIzol的比例加入TRIzol,反复吹打5-10次,使所有细胞充分消化至溶液澄清程度均一,转移到离心管或冻存管中;
悬浮细胞:离心收集细胞,弃培养液,用预冷PBS漂洗一次,按每5×106细胞加1mL TRIzol的比例加入TRIzol,反复吹打使所有细胞充分消化,转移到离心管或冻存管中;
液氮速冻后用封口膜封口。
微生物:建议选取处于对数生长期的菌液,高速离心收集菌体后,弃上清,加入3~5倍体积TRIzol,吹打至溶液澄清程度均一,液氮速冻后用封口膜封口。
运输方式:72小时内干冰运输。
备份:接收样品前要求客户分装备份,用于样品检测不合格时分析原因。
血清,血浆,exosome等样品属于特殊样品,提取风险较大,锐博生物不承诺提取的成功率。
其他特殊样品请与销售或技术支持联系。

表1和表2分别是DNA组织送样量与RNA组织送样量


表1 DNA组织送样量


注:全血样本需要使用 EDTA 抗凝的采血管收集样品(由于会影响实验,不能使用肝素抗凝),冷冻后,干冰运输送样。


表2 RNA组织送样量


注:

1) 全血:推荐使用RNAprotect® Animal Blood Tubes (Qiagen Cat# 76554)收集样品,使用方法按产品说明书,大体积干冰运送。不能达到以上要求的客户,可使用 EDTA
抗凝的采血管收集样品(不能使用肝素抗凝),颠倒混匀抗凝管8-10次,充分混匀后加入3倍血液体积的TRIzol或TRIzol LS试剂,保证RNA不被降解,放入-80 ℃冰箱中保
存,干冰运输送样。
2) 血清或血浆:推荐使用RNAprotect® Animal Blood Tubes(Qiagen Cat# 76554)收集样品,使用方法按产品说明书,大体积干冰运送。不能达到以上要求的客户,可按常
规方法分离血清/血浆后,加入3倍体积的TRIzol或TRIzol LS试剂,保证RNA不被降解,冷冻后,干冰运输送样。(血清类:从血液凝结到析出血清时间较长,易造成溶血。
可向新鲜全血中加入血液促凝剂加快血清的收集,缩短血清收集时间,收集血清后加入3倍体积的TRIzol或TRIzol LS试剂,放入-80℃冰箱中保存。)

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